上海粒成生物科技有限公司

基因编辑大鼠

粒成生物可为您提供基因敲除、点突变、基因敲入等多种基因编辑大鼠服务，还可为您提供SD、Wistar、F344、Brown Norway大鼠等多种品系选择，致力于为您构建更好的大鼠模型。

粒成生物可提供的大鼠类型

  • • SD大鼠：产仔多、生殖力强、生长发育快、抗病能力强、自发肿瘤率低、对性激素敏感性高。常用作营养学、内分泌学和毒理学等方面的研究。
  • • Wistar大鼠：性周期稳定，繁殖力强，生长发育快，性情温顺，抗病性强，自发肿瘤率低。广泛用于营养学、生理学、药理学、毒理学及病理生理学等的研究。
  • • F344 (CDF) 大鼠：旋转运动性差，血清胰岛素含量低，脑垂体大。可允许多种肿瘤移植生长，癌症发生的研究中应用较多。
  • • Wistar大鼠：性周期稳定，繁殖力强，生长发育快，性情温顺，抗病性强，自发肿瘤率低。广泛用于营养学、生理学、药理学、毒理学及病理生理学等的研究。
  • • Brown Norway大鼠：野生Norway大鼠的变种，毛呈褐色，最早用于遗传学研究。对实验性过敏性脑脊髓炎及自身免疫性复合型肾小球肾炎有抗性。

完全性基因敲除大鼠

完全性基因敲除大鼠是采用基因编辑技术，造成目的基因的功能区域被敲除，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的大鼠模型。粒成生物采用独特的受精卵处理方式使受精卵偏好同源重组修复路径，进而提高同源重组效率，制作周期快至3个月。

完全性基因敲除示意图

完全性基因敲除大鼠的建系原则与流程:

  1. 通过构建打靶载体，并将载体微注射至受精卵，获得测序鉴定阳性的F0代杂合子大鼠。
  2. F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行交配，获得PCR和测序鉴定阳性的F1代杂合子大鼠。
  3. 选择来自同一只F0代大鼠，基因型一致的F1代大鼠，达到性成熟后进行互配，可获得F2代大鼠。对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定，理论上，F2代大鼠中25%为纯合子，50%为杂合子，25%为野生大鼠。

基因敲除验证方法

  • • 基因型鉴定：采用PCR方法对基因组DNA进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物大小，以及测序分析确认基因敲除情况。
  • • RNA水平验证：通过RT-PCR或RNA-seq分析目的基因的转录本水平，确认基因表达是否被完全抑制。
  • • 蛋白水平验证：使用Western Blot或免疫组化方法检测目的蛋白的表达情况，验证基因敲除的效果。
基因敲除验证流程图

条件性基因敲除大鼠

条件性基因敲除大鼠是通过把两个LoxP位点插入到目的基因的⼀个或几个重要外显子的两端以制备出flox大鼠，该flox大鼠在与表达Cre重组酶大鼠杂交之前，该基因表达正常；当flox大鼠与组织特异性表达Cre酶的大鼠进行杂交后，可实现在特定的组织或细胞中敲除该基因，⽽在其它组织或细胞中该基因表达正常。

条件性基因敲除示意图

条件性敲除大鼠的建系原则与流程:

  1. 与野生型大鼠杂交：阳性CRISPR-Pro大鼠（+/flox）与野生型大鼠（+/+）杂交，获得F1代杂合子大鼠（+/flox）。
  2. 挑选一对F1代杂合子大鼠（+/flox）进行自交，获得F2代纯合子大鼠（flox/flox）。
条件性基因敲除大鼠建系流程图

基因敲入大鼠

基因敲入大鼠是利用基因编辑技术，针对靶基因设计，构建恒位的引导分子和相关元件引入特定的突变或外源基因，比如在目的基因上引入突变（模拟人类遗传疾病模型）或将报告基因（如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等）引入目的基因的特定位点，从而可以通过报告基因来跟踪目标基因的表达，也可以用报告基因取代大鼠本身的基因，做KO/KI同时发生。

基因敲入原理示意图

基因敲入大鼠的建系原则与流程:

  1. 通过构建打靶载体，并将载体里微注射至受精卵，获得测序鉴定阳性的F0代杂合子大鼠。
  2. F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行杂交，获得PCR和测序鉴定阳性的F1代杂合子大鼠。
  3. 选择来自同一只F0代大鼠，敲入位点一致的F1代大鼠，达到性成熟后进行同胞交配，可获得F2代大鼠。
  4. 对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定，理论上，F2代大鼠中25%为敲入位点一致的纯合子大鼠，有50%为只有一条染色体敲入的杂合子大鼠，有25%为野生型大鼠。
基因敲入大鼠建系流程图

转基因大鼠

制作转基因大鼠最常用的一种方法是DNA原核微注射，DNA原核微注射是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到大鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。粒业生物使用的PiggyBac系统DNA原微注射，制备的转基因鼠基因表达阳性率为常规原核DNA原微注射的2倍以上！

转基因示意图

转基因大鼠建系原则与流程:

  1. 原核显微注射获得PCR阳性F0代杂合子大鼠。原核显微注射导入的目的基因是将目的基因随机整合到大鼠的基因组，因代转基因大鼠（F0）将会有不同的整合位点，整合基因的拷贝数可能还不同的自代转基因大鼠中也不同，因此，每只F0代大鼠需要作为一个独立的谱系研究，并且与其它F0代大鼠分开进行繁殖。
  2. F0代大鼠达到性成熟后（8周）与野生型大鼠进行交配，获得F1代大鼠。
  3. 对交配获得的F1代大鼠进行基因型鉴定，理论上，F1代大鼠中有50%为转基因阳合子大鼠，50%为野生型大鼠。

注意事项:

  • • 每只F0代转基因基因型都不一样，不能进行它们之间的自交；可能先与野生型交配，筛选出基因型一致的F1。（假如F0代有多个位点的外源基于整合，F1还有可能有多种基因型）。
  • • 获得F1后后，可以进行蛋白表达鉴定，优先筛选出表达水平最后再进行后续的传代和繁殖。